本文是学习GB-T 34223-2017 核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测原理、仪器设备及器具、主要试剂、分析步骤
和结果分析。
本标准适用于生化试剂核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶产品的生产和检测。
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
SN/T 3926 出口乳、蛋、豆类食品中蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝法
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
核糖核酸酶 ribonuclease;RNase
水解核糖核酸(RNA) 中磷酸二酯键，生成寡核苷酸或单核苷酸的核酸酶。
3.2
脱氧核糖核酸酶 deoxyribonuclease;DNase
水解脱氧核糖核酸(DNA) 中磷酸二酯键，生成寡核苷酸或单核苷酸的核酸酶。
一定浓度的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
可分离分子质量不同的蛋白质，经
考马斯亮蓝(CBB) 染色，脱色成像后，通过计算进行核酸酶的纯度检测。
5.3 水平脱色摇床，转速45 r/min。
5.4 电子天平：精度为0.0001 g、0.01g和0.1 g。
本方法所用试剂均为分析纯，实验用水均为 GB/T 6882 规定的二级水。
GB/T 34223—2017
6.1 30%亚甲基双丙烯酰胺溶液(Acr-Bis)
取丙烯酰胺29.0 g,N,N'- 甲叉双丙烯酰胺1.0 g,加入60 mL
水，充分搅拌溶解，定容到100 mL。 用0.45 μm
微孔滤膜过滤除菌和杂质后储于棕色瓶，4℃避光保存。如有沉淀应过滤，两个月后溶液应
重新配制备用。
6.2 1.0 mol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液(Tris-HCI),pH
6.8
取12.12 g 三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于80 mL 的水中，充分搅拌溶解，用HCl
调 pH 值为6.8,定
容至100 mL, 室温保存备用。
6.3 1.5 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液(Tris-HCI),pH
8.8
取18.17 g 三羟甲基氨基甲烷溶于80 mL 的水中，充分搅拌溶解，用 HCl 调 pH
值为8.8,定容至
6.4 10%十二烷基磺酸钠(SDS) 溶液
取10.0 g 十二烷基磺酸钠充分溶于约80 mL 的水中，定容至100 mL,
室温保存备用。
取0.1 g 过硫酸铵于1.5 mL 离心管，加1 mL 水溶解，现配现用。
6.6 10倍 Tris-甘氨酸电极缓冲液
取30 g Tris、144g甘氨酸、10g SDS溶于800 mL 水中，定容至1L,
室温保存，使用时稀释10倍。
6.7 5倍十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
加样缓冲液
取1.25 mL1.0 mol/L Tris-HCl(pH 6.8)、SDS0.50 g、2.5 mL甘油、0.025g
溴酚蓝，用水溶解定容 至5 mL, 按照每管500 μL
分装后，4℃保存备用。临用前每管加0.078 g 二硫苏糖醇(DTT), 充分溶
解，现配现用。
染色液 A:考马斯亮蓝 G-2500.1 g、95%乙醇50 mL、85% 磷酸100 mL,
用水定容至1000 mL, 保
存备用。
染色液 B:考马斯亮蓝 R-2500.5 g、冰乙酸25 mL、 乙醇250 mL,
用水定容至500 mL, 室温保存。
取100 mL 冰乙酸、400 mL 甲醇，用水定容至1 L,室温保存。
分子质量为6.5 kDa～66.4 kDa或分子质量为6.5 kDa～200 kDa。
6.11 1.0 mg/mL 牛血清白蛋白标准溶液
取0.01 g 纯度≥98%的牛血清白蛋白，精确至0.0001 g,溶于10 mL 浓度为0.15
mol/L 的 NaCl
溶液中。
GB/T 34223—2017
按照SN/T 3926 进行测定。
称取0.025 g 待测样品，精确至0.0001 g,溶解于10 mL 水中，浓度为2.5 mg/mL。
其中核糖核酸 酶和脱氧核糖核酸酶样品分别稀释为浓度0.625 mg/mL、1.25
mg/mL,现配现用，并将稀释后的待测
样品20μL 与5倍电泳加样缓冲液5 μL 在一个离心管中混合，100℃水浴加热10 min
后，冷却备用。
将电泳所使用的玻璃板洗净、晾干，短板向外，长板向内嵌入塑料架中，并固定。
组装制胶装置，按表1分别配制4%浓缩胶和12%分离胶溶液。
表 1 浓缩胶、分离胶配方
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| 30% Acr-Bis |
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| 10% APS |
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| 10% SDS |
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核糖核酸酶选择分子质量为6.5 kDa～66.4 kDa
的标准蛋白、脱氧核糖核酸酶选择分子质量为
6.5 kDa～200 kDa 的标准蛋白，上样量均为10μL,每个样品设3个重复。
在配置好的电泳装置系统中加入电极缓冲液，浸没电极，采用微量加样器分别吸取待测样品，初始
电泳按照每块胶加70 V
电压，待样品中的溴酚蓝指示剂超过浓缩胶与分离胶分界线时，加大电压至
110 V继续电泳，当溴酚蓝指示剂前沿到达电泳槽底部时停止电泳。
电泳结束后将凝胶移至染色盒中，加入染色液 B,
置于水平摇床染色至条带清晰，随后倒出染色液
B,加入脱色液，置于水平摇床上脱色至凝胶底色脱尽且蛋白条带清晰可辨，期间可更换脱色液。
GB/T 34223—2017
将待测样品电泳条带与不同分子质量标准蛋白质电泳条带对比，并根据核糖核酸酶和脱氧核糖核
酸酶标称分子质量进行判定。
脱色后，将凝胶转移至蛋白印记成像系统中成像，拍照记录样品3条平行试验条带。再将拍好的图
像于电泳凝胶定量分析软件中计算样品中核糖核酸酶或者脱氧核糖核酸酶所占的比例，按照式(1)
计算：
P=R×C×100% ………………………… (1)
式中：
P— 样品相对纯度；
R— 样品中核糖核酸酶或者脱氧核糖核酸酶所占的比例，%;
C—— 样品蛋白质含量，%。
样品3个重复结果的平均值与待测样品蛋白含量的乘积值即为待测样品相对纯度，结果用百分比
表示(%),计算结果保留小数点后两位。
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。
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